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Intro ......

 

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Index & Contents

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1. 4ml TE buffer 로 crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 녹인다. 또한 4.4g CsCl 첨가하여 용해시키고 10mg/ml ethidium bromide의 0.4ml를 가한다.

<주의할점>

Ethidium bromide는 돌연변이원이며 환경에 매우 위험한 물질이므로 이용시 신중하게 해야하며 장갑을 끼고 실험을 하도록 한다.

 

ethidium bromide는 용액에 남아있는 단백질과 화합물을 이루어 진한 적생을 형성하여 침전된다. 이 침전물은 lysate-CsCl/ethidium bromide 용액을 실온, ～2000×g로 원심분리 하여 제거할 수 있다. 이 절차후에는 protein/ethidium bromide complex는 용액의 상위부 위에 하나의 disc를 형성한다. 용액을 pipett을 이용하여 disc 아래부위만을 뽑아낸다.

2. 5-ml ultracentrifuge tube에 용액을 옮긴다. 필요시 CsCl/TE 용액으로 채우고 밀봉한다. 원심분리(3.5hr at 20℃, 500,000×g 또는 14hr at 350,000×g)에서 원심분리하여 plasmid band를 형성시킨다.

 

이 step은 매우 중요한 부분으로 원심분리시 온도가 15℃보다 이하에서 시행하여야 한다. 구배를 하기 위해서 고농도의 cesium chloride와 높은 원심력이 필요하기 때문이며 낮은 온도에서 시행시 cesium chloride가 tube 바닥으로 침전이 된다.

3. 20-G needle을 tube의 상위부분에 조심스럽게 삽입하고 3-ml syringe과 다른 20-G needle결합시켜 plasmid band의 ～ 1cm 아랫부위에 주입시켜 plasmid band를 흡입한다.

 

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