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[생물자료] PCR[유전자진단] 원리 및 실험 방법

유전자 진단 방법 - PCR

PCR(Polymerase Chain Reaction)법은 유전자 진단 방법중 하나로 특정 DNA 영역을시험 내에서 효소에 의해 증폭하는 방법이다. 1985년 Mullis 등에 의해 개발되었고, 그는 1993년 노벨 화학상을 받았다. PCR이 등징하기전, DNA 진단을 위해서는 하프로이등당 30억개의 염기쌍으로 이루어지는 사람의 게놈 DNA를 재조합 DNA 기술을 이용한 유전자의 클론닝이 필요하였다. 이러한 이유에서 대장균이나 파지에 대한 지식이 많이 필요하였으며, 시간과 노력이 많이 들어 DNA 진단의 임상 보급에 장애가 되어 있었다.

PCR법은 이와 같은 복잡한 단계를 불과 수시간의 효소 반응으로 바꾸었으며, 그 응용성이 매우 높은 DNA 진단의 중심이 되는 기법이 되었고, 분자 생물학적인 접근을 필요로 하는 모든 생명 과학 분야에서 필수적인 기술이 되었다.

1. PCR의 원리

PCR의 원리는 3가지 단계를 반복하여 특정 DNA 영역을 증폭한다.

1) 제1단계는 게놈 DNA를 단일쇄로 변성시킨다.

2) 제2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 20염기 정도의 합성 올리고뉴클레오티드를 단일쇄 DNA에 결합(annealing) 시킨다.

3) 제3단계는 올리고뉴클레오티드를 시발체(Primer)로 고열에 내성인 DNA 폴리메라제에 의해 DNA를 합성한다.

이상의 싸이클을 25∼30회 반복한다.

이 반응에 의해 이론적으로 약 100만배(n 싸이클 후에 2n배) 증폭되지만, 실제로 싸이클을 진행하면 반응이 고원기에 달하여 수십만배 정도가 증폭 된다. 원래 방법에서는 DNA 합성에서 대장균 DNA 폴리메라제인 Klenow flagment가 사용되었지만, 그 후 내열성 Taq DNA 폴리메라제가 이용되어 자동화가 간편하게 되었다.

2. 유전자 진단에 응용

▶ 미지의 변이 분석

변이 유전자의 분석에서는, 특정 영역에 변이 존재여부를 알고자 함이며 몇 가지 방법이 있다.

(1) RNase 또는 화학적 절단에 의한 변이 검출법

표지된 정상 배열 RNA 소식자를 PCR 증폭한 DNA에 보합결합하면, 변이 부위에 miss match가 일어나고, 이곳이 RNase A에 의해 절단이 일어난다. 이것을 겔 전기영동하여 염기 치환의 존재와 대강의 위치를 아는 방법이다.

RNase A는 피리미딘의 3` 측만을 절단하며 모든 염기 치환을 알아낼 수 있지는 않다. 따라서 miss match 염기 C나 T를 화학적으로 절단하는 방법이 개발되고 있는데, 센스…(생략)

 

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